استخراج DNA و RNA از میکروارگانیسم ها و بافت های گیاهی

[vc_row][vc_column][vc_column_text]

استخراج DNA برای اولین بار در سال ۱۸۶۹توسط فردریش میشر، پزشک سوئیسی، انجام گرفت. استخراج DNA به عنوان اولین مرحله در تحقیقات و بررسی های ژنتیکی به منظور مطالعه علت ژنتیکی بیماری ها، تعیین توالی ژنوم و تشخیص باکتری ها و ویروس ها و انجام آزمایشات پدر-مادری و علم پزشکی قانونی از اهمیت اساسی برخوردار است

استخراج RNA مرحله‌ای کلیدی در تحقیقات و بررسی های ژنتیکی به منظور دستیابی به بیان ژن، تنظیمات مرتبط در بیان ژن و ترجمه می‌باشد. با توجه به تنوع فراوان این روش‌ها، اشتراکاتی هم مابین آن‌ها وجود دارد. آن جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی است. این DNA می‌تواند DNA کروموزومی، پلاسمید و یا باکتریوفاژ باشد. می‌تواند از تمام نمونه‌های بیولوژیکی مانند بافت‌های زنده و فیکس‌شده، سلول‌ها و … استخراج شود. استخراج DNA باید به ملایم‌ترین شیوه ممکن لیز بافت صورت بگیرد. تا از آسیب به DNA و شکستن آن به قطعات کوچکتر جلوگیری شود.

استخراج DNA برای آنالیز ژنتیکی آن به منظور اهداف علمی، پزشکی  ضروری است. دانشمندان از DNA استخراج شده در مواردی همچون وارد کردن DNA بیگانه به درون سلول‌ها و یا در تشخیص استفاده می‌کنند. در پزشکی این کار ارزش تشخیصی دارد منابع DNA مورد استفاده بسیار متنوع بوده و می‌تواند از هر ارگانیسم زنده و غیرزنده‌ای به دست آید. بنابراین واضح است که هر کدام از روشهای استخراج DNA باید مطابق با نمونه مورد نظر باشند. به نحوی که بتوان با استفاده از آن‌ها به طور موثری DNA را از نمونه مورد نظر جداسازی نمود.

آسان‌ترین فرایند استخراج، استخراج DNA از باکتری‌هاست؛ چون سلول‌های باکتریایی دارای ترکیبات ساختاری فراوانی زیر دیواره سلولی و غشای خود نیستند. باکتری‌هایی مانند E. coli، از آن جایی که فرایند استخراج DNA آسان‌تری دارند، ارگانیسم انتخابی به منظور دستکاری تمام انواع ژن‌ها می‌باشند. در E. coli ، هر دو نوع DNA ژنومی و پلاسمید موجود است و نحوه افتراق آن‌ها از همدیگر، طول بسیار بلندتر DNA ژنومی است.

[/vc_column_text][/vc_column][/vc_row][vc_row][vc_column stretch=”1″][us_page_block id=”13722″][/vc_column][/vc_row][vc_row][vc_column width=”2/3″][us_message color=”yellow” icon=”fas|dna” css=”%7B%22default%22%3A%7B%22background-color%22%3A%22_content_overlay%22%7D%7D”]تخریب سلول

[/us_message][vc_column_text]

معمولا استخراج DNA با لیز یا از هم گسستن بافت و سلول‌ها آغاز می‌شود. به این منظور غشای سلولی باید تخریب گردد. این فرایند برای تخریب ساختارهای پروتئینی و نیز آزاد کردن اسیدنوکلئیک از هسته ضروری است. در حالت کلی، لیز نمونه در محلول نمکی حاوی دترجنت‌ها و پروتئازها مانند Proteinase K انجام گرفته. این کار موجب از هم گسستن ساختارهای سلولی و حل شدن غشا می‌شود. در باکتری‌ها، آنزیمی به نام لیزوزوم، پپتیدوگلیکان‌ها را که ترکیب اصلی دیواره سلولی هستند، هضم می‌کند. سپس شوینده‌ای (detergent) مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) با بر هم زدن ساختار لیپیدی دو لایه، غشا را تخریب می‌نماید.

در استخراج DNA در مورد سایر ارگانیسم‌ها نحوه تخریب سلول بستگی به ساختارشان دارد. نمونه‌های بافتی از جانوران و گیاهان باید به قطعات کوچکتری تقسیم شوند. تا ترکیبات داخل سلولی شان آزاد گردد. سلول‌های گیاهی باید ابتدا در مخلوط‌کن کاملا تکه‌تکه شوند. باعث میشود دیواره‌های سلولی سخت شکسته شوند. سپس بافت دیواره به کمک آنزیمها هضم می‌گردد.

[/vc_column_text][/vc_column][vc_column width=”1/3″][us_separator size=”custom” height=”6rem”][us_image image=”13499″ align=”center”][/vc_column][/vc_row][vc_row][vc_column width=”2/3″][us_message color=”yellow” icon=”fas|dna” css=”%7B%22default%22%3A%7B%22background-color%22%3A%22_content_overlay%22%7D%7D”]جدا کردن قطعات سلولی

[/us_message][vc_column_text]

متد دیگری که به منظور جدا کردن قطعات سلولی استفاده می‌شود، استخراج شیمیایی با استفاده از فنول است. این روش به منظور جداسازی پروتئین‌های ناخواسته از DNA است. فنول اسیدی است که می‌تواند ۶۰ تا ۷۰ درصد مولکول‌های زیستی از جمله پروتئین‌ها را از بین ببرد. فنول چندان در آب محلول نیست و پس از مخلوط شدن با نمونه آبی حاوی DNA و پروتئین، دو فاز مخلوط از یکدیگر جدا می‌شوند. پروتئین در لایه فنولی و نوکلئیک‌اسید در لایه آبی قرار می‌گیرد. دو لایه توسط سانتریفیوژ از یکدیگر جدا می‌شوند و به این ترتیب DNA موجود در لایه آبی از فنول جدا می‌گردد.

بعد از جدا شدن مولکول‌های DNA از پروتئین‌ها، نمونه هنوز دارای هر دو نوع نوکلئیک‌اسید RNA و DNA است. از آن‌جایی که RNA نیز یک نوکلئیک اسید است، در فنول محلول نیست. آنزیمی به نام ریبونوکلئاز (RNase)، RNA را به ریبونوکلئوتیدها تبدیل می‌کند. در نتیجه این کار، تولید نمونه‌‌ DNA ای است که در محلولی از قطعات RNA و ریبونوکلئوتیدها قرار دارد. در صورت افزودن حجم یکسانی از الکل، قطعه بسیار بزرگ DNA از فاز آبی جدا و توسط سانترفیوژ استخراج می‌گردد و ریبونوکلئوتیدها به صورت محلول باقی می‌مانند. DNA حاصل می‌تواند در آزمایشات مختلف استفاده شود.

در مهندسی ژنتیک معمولا سه نوع DNA استخراج می‌شود: کل DNAهای موجود در سلول  (Total DNA)، DNA پلاسمید و DNA  باکتریوفاژ. Total DNA اغلب به عنوان منبع تهیه ژن‌ها به منظور کلون کردن استفاده می‌شود و شامل DNA ژنومی ارگانیسم و سایر مولکول‌های DNA موجود در آن مانند پلاسمید است. روش استخراج DNA خالص پلاسمیدی، همانند total DNA است. با این تفاوت که در یکی از مراحل پلاسمید باید از سایر مولکول‌های DNA جدا شود.

DNA پلاسمیدها در فرایندهای بیولوژی مولکولی مدرن باکتریوفاژ غالبا زمانی استخراج می‌شود که به عنوان وکتور مورد نیاز باشد. DNA پلاسمیدها معمولا از ذرات ویروسی استخراج می‌شود، نه از سلول‌های باکتریایی آلوده به ویروس. البته استثنائاتی هم وجود دارد. در این حالت تکنیک‌های خاصی باید برای از میان ‌بردن کپسید به کار رود.

[/vc_column_text][/vc_column][vc_column width=”1/3″][us_separator size=”custom” height=”6rem”][us_image image=”13497″ align=”center”][/vc_column][/vc_row]